مشاكل PCR

عند القيام بتفاعل pcr قد نواجه عدة مشاكل بحيث لا يتم التفاعل وقد لا نحصل على النتيجة المرجوة وهناك العديد من المشاكل التي يمكن ان تظهر .
pcr هو باختصار تفاعل لزيادة نسخ لقطعة محددة  من DNA . بحيث يصبح من السهل الكشف عنها :

كأول مشكلة يمكن ان تظهر هي ان لا  يحدث التفاعل أي ان لا يكون هناك تضاعف لل DNA   .اي لا يحصل Amplification  . وهذا الامر قد يكون نتيجة للعديد من الامور منها عدم ارتباط  البرايميرات – او ان انزيم taq  لا يعمل اوان هناك خلل في العينة المأخوذة  .

وللبحث عن المشكلة وحلها يمكن اجراء ما يلي :
1- يمكن اعادة التفاعل حيث يمكن ان يكون الخطأ نتيجة نسيان اضافة احد المواد الى انبوب الاختبار

2- يمكن تحضير محلول من dNTPs جديد حيث ان dNTPs يمكن ان تتحطم نتيجة التجميد وفك التجميد المتتالي لمحلول dNTPs

3- التأكد من صلاحية عينة DNA   التي يجرى عليها الاختبار حيث يمكن ان ايضا ان تتعرض لقوى وعوامل تقوم بتخريبها ويمكن اجراء الاختبار على عينات جديدة . للتاكد من مصدر المشكلة  ويجب تحديد نقاوة و تركيز DNA

4- قد تكون  annealing temperature غير مناسبة وبالتالي تؤثر على ارتباط البريمرات مما قد يؤدي الى ارتباط مع تسلسلات غير نوعية او قد يؤدي الى عدم ارتباط ويمكن في هذه الحالة تغيير حرارة annealing temperature

5- تركيز عينة DNA   المستخدمة لاجراء التفاعل قد لايكون مناسبا فقد يكون التركيز قليلا وبالتالي الكمية المستخدمة غير كافية لاجراء التفاعل مما يؤدي لعدم حدوث التفاعل . او قد تكون الكمية المستخدمة لاجراء التفاعل كبيرة بحيث يزداد كمية الشوائب معها مما يسبب تثبيط التفاعل . وينصح عادة بتجربة تراكيز بين

10- 200 نانومكل .

6- البريمرات  قد تكون غير مناسبة مما قد تؤدي لعدم ارتباط مع template  وبالتالي عدم حصول تضاعف حيث يمكن ان تشكل البريمرات بنى ثانوية او تشكل ثنائيات مع بعضها تمنعها من الارتباط مع التسلسل الهدف .

 

المشكلة الثانية التي يمكن ان تظهر خلال تفاعل pcr هو ظهور عصابات غير طبيعية عند اجراء الرحلان الكهربائي :

1-قد تظهر عصابة شاذة غير متوقعة .وهنا ننظر للشاهد فاذا ظهرت العصابة معها ايضا فهذا يدل على تلوث المحاليل ونقوم بتحضير محاليل جديدة.

 

2- اذا كان الشاهد لا يحوي العصابة المذكورة فقد يدل ذلك على ارتباط غير نوعي للبرايمير حيث قد يرتبط بتسلسلات غير نوعية كما في حالة “pseudo genes” وهنا نغير من تصميم البرايمير حيث ان البريمرات القصيرة تميل عادة لان تكون غير نوعية

وقد تكون عدم النوعية نتيجة التركيز العالي للبرايمير لذلك يمكن ضبط التركيز “ويمكن تغير البرنامج الحراري للحصول على ارتباط نوعي ”

3- التراكيز العالية من taq  تسبب تفاعلات غير نوعية وعادة تستخدم 1 حدة لكل 25 ميكرون من التفاعل .لذلك يجب ضبط تركيزه .

 

 

المشكلة الثالثة : هي ظهور عصابة عند اجراء الرحلان ولكن العصابة تكون غير اضحة وضعية وهذا يدل على وجود amplification  ولكن بنسبة ضعيفة  ويمكن ان نقوم بما يلي :
1- نغير من البرنامج الحراري annealing temperature  “زيادتها او نقصانها بحيث تحقق افضل ارتباط بين برايمير و التسلسل الهدف ”

 

2- نزيد عدد الدورات “cycles”

 

3- يمكن استعمال الناتج كtemplate  لتفاعل جديد بتكرار التفاعل باستعمال نفس البريمرات.

 

4- يمكن ان نقوم بتغيير تراكيز : البوليميراز – البرايمير _ العينة ” نزيدها”

 

  • البرايمير تراكيزه بين 0.1 – 1 uM
  • Taq : تركيزه بحدود 1 وحدة لكل 25 ميكروليتر من التفاعل .
  • Mg : تراكيزه عادة بين 1- 4 M  ولكن بما ان dNTPs تحجز جزيئات Mg فان التراكيز العالية من dNTPs تستوجب زيادة تراكيز Mg

اضف رد

لن يتم نشر البريد الإلكتروني . الحقول المطلوبة مشار لها بـ *

*